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L’essai in vivo d’électrophorèse sur gel en conditions alcalines de cellules isolées, aussi appelé test des comètes est une méthode mesurant les cassures de brins d’ADN dans les cellules eucaryotes. Chaque groupe traité est composé au minimum de 5 animaux d’un même sexe (ou de chaque sexe si besoin est). On utilise également un groupe témoin positif et un groupe témoin négatif. Les animaux reçoivent un traitement quotidien sur une durée de 2 jours ou plus, permettant au produit chimique d’essai d’atteindre le tissu cible, celui-ci peut être le foie, le rein, ou tous autres tissus si cela est justifié. Les tissus à étudier sont disséqués et des suspensions de cellules/noyaux isolés sont préparées, puis incluses dans un gel d’Agarose pour être fixé sur des lames. Les cellules/noyaux sont traitées avec un tampon de lyse pour éliminer la membrane cellulaire et/ou nucléaire. L’ADN nucléaire dans l’agar est ensuite soumis à une électrophorèse à pH élevé produisant des structures ressemblant à des comètes qui, si l’on utilise les colorants fluorescents appropriés, peuvent être observées par microscopie à fluorescence. En fonction de leur taille les fragments d’ADN migrent de la tête vers la queue de la comète, et l’intensité de la queue de la comète relative à l’intensité totale (tête plus queue) reflète l’ampleur des cassures de l’ADN.

Le test de reproduction chez l'espèce Potamopyrgus antipodarum (hydrobie des antipodes) a pour objet l’évaluation des effets potentiels d’une exposition prolongée aux produits chimiques sur la reproduction et la survie de lignées parthénogénétiques de cet escargot d’eau douce. À cet effet, on expose des femelles adultes à une gamme de concentrations du produit chimique testé. Le produit chimique testé est mélangé à de l’eau de dilution (eau reconstituée), ajouté aux béchers destinés à l’essai, puis des escargots adultes sont placés dans les béchers. Si l’essai porte sur des « produits chimiques difficiles » (c’est-à-dire volatiles, instables, facilement biodégradables ou adsorbants), il est possible de conduire l’essai en conditions dynamiques, en s’écartant de la conception semi-statique avec renouvellement du milieu à intervalles réguliers. On étudie la survie de P. antipodarum au cours de la période d’exposition de 28 jours, et la reproduction à l’issue des 28 jours d’exposition au produit chimique testé. La reproduction est mesurée par le nombre d'embryons contenus dans la poche embryonnaire (sans distinction du stade de développement) à la fin de la période d'exposition de 28 jours. L’effet toxique du produit chimique testé sur le nombre d’embryons est exprimé sous la forme d’une CEx, établie en appliquant aux données un modèle d’ajustement adapté afin d'estimer la concentration qui produirait une réduction de x % du nombre d’embryons. Il est également possible d’exprimer l’effet toxique du produit testé par la concentration sans effet observé et la concentration minimale avec effet observé (CSEO/CMEO).

L'essai in vitro de mutation génique sur des cellules de mammifères peut être employé pour détecter des mutations induites par les substances chimiques. Dans cet essai, les systèmes genetiques utilisés permettent de détecter une mutation sur les loci de l’hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HPRT) et d’un transgène de la xanthine-guanine phosphoribosyl transferase (XPRT). Les essais de la mutation de HPRT et de XPRT détectent différents types d’événements génétiques. Des cellules en suspension ou en culture monocouche sont exposées à quatre concentrations analysables de la substance d'essai au moins, avec et sans activation métabolique, pendant une période appropriée. Elles sont repiquées pour déterminer la cytotoxicité et pour permettre l'expression phénotypique avant la sélection. La cytotoxicité est habituellement déterminée en mesurant l'efficacité de clonage relative (survie) ou la croissance totale relative des cultures après la période de traitement. Les cultures traitées sont maintenues dans le milieu de croissance pendant une période suffisante, caractéristique de chaque locus et de chaque type cellulaire, afin de permettre l'expression phénotypique presque optimale des mutations induites. La fréquence de mutant est déterminée par l’ensemencement d’un nombre connu de cellules dans le milieu contenant l'agent sélectif pour détecter des cellules mutantes, et dans le milieu sans agent sélectif pour déterminer l'efficacité de clonage (viabilité). Après un temps approprié d'incubation, des colonies sont comptées.

La présente Ligne directrice porte sur le danger de corrosion cutanée pour la santé humaine faisant suite à une exposition avec un produit chimique. La corrosion cutanée désigne la survenue de lésions irréversibles de la peau qui se manifestent par une nécrose visible, selon la définition du Système Général Harmonisé pour la Classification et l’Étiquetage des produits chimiques.Cette Ligne directrice décrit une procédure in vitro permettant d’identifier les substances et mélanges corrosifs et non corrosifs, en faisant appel à un épiderme humain reconstitué qui reproduit fidèlement les propriétés histologiques, morphologiques, biochimiques et physiologiques des couches supérieures de la peau humaine. La procédure sur épiderme humain reconstitué part du principe que les substances corrosives sont capables de pénétrer dans le stratum corneum (couche cornée) par diffusion ou érosion, et sont cytotoxiques pour les cellules des couches sous-jacentes. Deux réplicats sont employés pour chaque traitement (ou durée d'exposition), et pour les contrôles. Les substances corrosives sont identifiées sur la base de leur capacité à réduire la viabilité cellulaire en dessous des valeurs seuils définies pour des périodes d'exposition spécifiques. La viabilité cellulaire est mesurée via la conversion enzymatique du colorant vital MTT en un sel de formazan bleu mesuré quantitativement après son extraction des tissus. Les substances corrosives sont mises en évidence par leur capacité à faire chuter la viabilité cellulaire sous un seuil prédéterminé.Les produits chimiques colorés et ceux qui interfèrent avec le MTT peuvent également être testés par procédure HPLC.Plusieurs méthodes validées sont référencées dans la Ligne directrice et suivent la procédure décrite ci-dessus. Certaines méthodes référencées permettent par ailleurs la sous-catégorisation des produits corrosifs.

Le but de l'essai in vitro d'aberration chromosomique est d'identifier les agents qui causent des aberrations chromosomiques structurales dans les cellules mammifères cultivées. Les aberrations structurales peuvent être de deux types : chromosomiques ou chromatidiques. L'essai in vitro d'aberration chromosomique peut utiliser des cultures de lignées cellulaires établies, des souches cellulaires ou des cultures de cellules primaires. Des cultures cellulaires sont exposées à la substance d'essai (liquide ou solide) avec et sans activation métabolique pendant environ 1.5 fois le cycle cellulaire normal. Au moins trois concentrations analysables de la substance d'essai devraient être employées. Il faut normalement réaliser les cultures en doublon à chaque niveau de dose. À intervalles prédéterminés après exposition des cultures de cellules à la substance d'essai, les cellules sont traitées avec une substance qui bloque la métaphase, récoltées et teintées. Les cellules métaphasiques sont analysées au microscope pour déceler les aberrations chromosomiques.

La présente ligne directrice décrit les effets d'un produit chimique d’essai sur le fonctionnement de la reproduction chez le mâle et la femelle. Elle a été mise à jour par l'ajout de paramètres relatifs à la détection des perturbateurs endocriniens, en particulier la mesure de la distance ano-génitale et l’examen de la persistance du mamelon chez les petits, ainsi qu'un examen thyroïdien. La substance d’essai est administrée par doses graduées à plusieurs groupes de mâles et de femelles. Les mâles doivent être traités pendant au moins quatre semaines ; les femelles doivent être traitées tout au long de l’étude (approximativement 63 jours). Normalement des accouplements « un mâle pour une femelle » doivent être employés dans cette étude. Cette Ligne directrice utilise le rat. Il est recommandé que la substance d’essai soit administrée oralement par gavage. Ceci devrait être fait avec une dose unique quotidienne en utilisant une sonde gastrique ou une canule d'intubation appropriée. Chaque groupe devrait initialement inclure au moins 10 animaux de chaque sexe. Généralement, au moins trois groupes d'essai et un groupe de contrôle devraient être employés. Des niveaux de dose devraient être choisis, en tenant compte de toutes données de toxicité existantes et de (toxico-) cinétique disponibles. Les résultats de cette étude incluent des observations cliniques, la mesure du poids corporel et la consommation de nourriture/eau, la surveillance du cycle œstral, la mesure/observation des caractéristiques de la descendance, un examen hématologique et de biochimie clinique, de même qu’une autopsie générale et l'histopathologie. Les résultats de cette étude de toxicité devraient être évalués en termes d'effets observés, autopsie et résultats microscopiques. L'évaluation inclura le rapport entre la dose de la substance d'essai et la présence ou l'absence d’observations. En raison de la période courte du traitement du mâle, l'histopathologie du testicule et l'épididyme doivent être pris en compte avec les données de fertilité, lors de l’évaluation des effets reproducteurs mâles.

L’essai de mutation létale dominante a pour but de détecter si certaines substances chimiques engendrent des mutations résultant d’aberrations chromosomiques dans les cellules germinales. En outre, l’essai de mutation létale dominante se prête bien à l’évaluation de la génotoxicité, car, malgré des variations entre les espèces, les facteurs du métabolisme in vivo, la pharmacocinétique et les processus de réparation de l’ADN sont actifs et contribuent aux réponses. L’apparition d’une mutation létale dominante à la suite d’une exposition à un produit chimique d’essai indique que cette substance a affecté le tissu germinal de l’animal étudié. La LD 478 initiale a été adoptée en 1984. La présente version modifiée de cette ligne directrice reflète plus de trente années d’expérience de cet essai et tient compte des possibilités de l’intégrer ou de le combiner à d’autres essais de toxicité, notamment pour le développement, la reproduction ou encore des essais de génotoxicité; cependant, étant donné les limitations de l’essai et le grand nombre d’animaux utilisés, cet essai n’a pas vocation à être utilisé en première intention, mais plutôt comme méthode d’essai supplémentaire quand il n’existe pas d’alternative pour satisfaire les exigences réglementaire.

Cette Ligne directrice décrit une méthode pour évaluer les effets de substances chimiques dans le sol sur la reproduction de l’espèce d’acariens Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer Canestrini (Acari: Laelapidae). Elle s’applique à des substances solubles dans l’eau ou insolubles, mais pas à des substances volatiles. 28-35 jours après le début de la ponte des œufs, des femelles adultes d’âge similaire sont exposées à un ensemble de concentrations d’une substance d’essai mélangée à 20 g (poids sec) de sol artificiel. Selon la mesure finale (ECx, NOEC ou les deux), cinq à douze concentrations doivent être testées. Il est recommandé de préparer au moins deux à quatre réplicats pour chaque concentration d’essai et six à huit réplicats pour le témoin, chaque réplicat comportant 10 animaux. A 20°C, le test dure 14 jours après l’exposition des femelles, ce qui permet à la progéniture témoin d’atteindre l’étape de deutonymphe. Le nombre de femelles survivantes (pour un test valide, mortalité ≤ 20%) et le nombre de jeunes acariens par récipient (pour un test valide, au moins 50) sont déterminés. La fécondité des acariens exposés à la substance d’essai est comparée à celle des femelles témoins afin de déterminer la ECx (p.ex. EC10, EC50) ou la concentration pour laquelle aucun effet n’est observé (NOEC). Toutes autres différences observées dans le comportement et la morphologie par rapport aux acariens témoins doivent être reportées.

L'essai in vitro de mutation génique sur des cellules de mammifères peut être employé pour détecter des mutations induites par les substances chimiques. Cette Ligne directrice comprend deux essais de mutation génique, avec deux lignées cellulaires spécifiques tk hétérozygotes : les cellules L5178Y tk+/-3.7.2C pour le test du lymphome de souris (mouse lymphoma essai) (MLA), et les cellules TK6 tk+/-   pour l’essai TK6. Les types d’événements génétiques détectés en utilisant le locus tk comprennent soit les mutations géniques que les changements chromosomiques. Des cellules en suspension ou en culture monocouche sont exposées à quatre concentrations analysables de la substance d'essai au moins, avec et sans activation métabolique, pendant une période appropriée. Elles sont repiquées pour déterminer la cytotoxicité et pour permettre l'expression phénotypique avant la sélection. La cytotoxicité est habituellement déterminée en mesurant l'efficacité de clonage relative (survie) ou la croissance totale relative des cultures après la période de traitement. Les cultures traitées sont maintenues dans le milieu de croissance pendant une période suffisante, caractéristique de chaque locus et de chaque type cellulaire, afin de permettre l'expression phénotypique presque optimale des mutations induites. La fréquence de mutant est déterminée par l’ensemencement d’un nombre connu de cellules dans le milieu contenant l'agent sélectif pour détecter des cellules mutantes, et dans le milieu sans agent sélectif pour déterminer l'efficacité de clonage (viabilité). Après un temps approprié d'incubation, des colonies sont comptées.

L'essai d'aberration chromosomique in vivo sur mammifères est employé à l’identification des composés d'essai qui induisent des aberrations structurales dans des cellules de moelle osseuse d’animaux, généralement des rongeurs (rats, souris et hamsters chinois). Les aberrations structurales peuvent être de deux types : chromosomiques ou chromatidiques. Des animaux sont exposés à la substance d'essai (liquide ou solide) par une voie d'exposition appropriée (habituellement par gavage via une sonde gastrique ou d’une canule de tubage appropriée, ou par injection intrapéritonéale) et sont sacrifiés après des délais appropriés de traitement. Avant le sacrifice, les animaux sont traités avec un inhibiteur de fuseau. Des préparations chromosomiques sont alors faites à partir des cellules de moelle et colorées, et des cellules de métaphase sont analysées pour mettre en évidence les aberrations chromosomiques. Chacun des groupes traités et de contrôle doivent inclure au moins 5 animaux analysables par sexe. La dose de limite est 2000 de mg/kg pc/jour pour le traitement jusqu'à 14 jours, et de 1000 mg/kg pc/jour pour le traitement de plus de 14 jours.