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  • 28-juillet-2015

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    Essai n° 491 : Méthode d'essai d'exposition de courte durée in vitro pour l'identification des produits chimiques i) provoquant des lésions oculaires graves ou ii) ne relevant d'aucune classification pour irritation oculaire ou lésion oculaire grave

    Cette Ligne directrice décrit un test d’exposition de courte durée in vitro de cytotoxicité, réalisé sur une monocouche confluente de fibroblastes de cornée de lapin du Statens Seruminstitut (SIRC), cultivés sur des plaques microtitres 96 puits. Après 5 minutes d’exposition à un produit chimique testé, on détermine quantitativement la cytotoxicité en mesurant, à l’aide du test MTT, la viabilité relative des cellules SIRC. L’observation d’une diminution de la viabilité cellulaire est utilisée pour prédire les effets indésirables potentiels pouvant provoquer des lésions oculaires. La viabilité cellulaire est évaluée par un dosage quantitatif des cristaux de formazan bleu extraits des cellules et produits par les cellules vivantes lors de la conversion enzymatique du colorant vital MTT, encore appelé Bleu de thiazol. La viabilité cellulaire observée est comparée à celle du témoin avec solvant (viabilité relative) et utilisée comme estimation du danger potentiel pour les yeux que présente le produit chimique testé. Les produits chimiques testés sont classés dans la catégorie 1 du SGH de l’ONU lorsqu’une viabilité cellulaire inférieure ou égale à (≤) 70% est observée aux deux concentrations testées (5 % et 0.05 %). À l’inverse, les produits chimiques pour lesquels la viabilité cellulaire est supérieure à (>) 70 % aux deux concentrations testées (5 % et 0.05 %) sont classés « sans catégorie » selon le système SGH.

  • 28-juillet-2015

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    Essai n° 431 : Corrosion cutanée in vitro : Essai sur modèle de peau humaine

    La présente Ligne directrice porte sur le danger de corrosion cutanée pour la santé humaine faisant suite à une exposition avec un produit chimique. La corrosion cutanée désigne la survenue de lésions irréversibles de la peau qui se manifestent par une nécrose visible, selon la définition du Système Général Harmonisé pour la Classification et l’Étiquetage des produits chimiques.

    Cette Ligne directrice décrit une procédure in vitro permettant d’identifier les substances et mélanges corrosifs et non corrosifs, en faisant appel à un épiderme humain reconstitué qui reproduit fidèlement les propriétés histologiques, morphologiques, biochimiques et physiologiques des couches supérieures de la peau humaine. La procédure sur épiderme humain reconstitué part du principe que les substances corrosives sont capables de pénétrer dans le stratum corneum (couche cornée) par diffusion ou érosion, et sont cytotoxiques pour les cellules des couches sous-jacentes. Deux réplicats sont employés pour chaque traitement (ou durée d'exposition), et pour les contrôles. Les substances corrosives sont identifiées sur la base de leur capacité à réduire la viabilité cellulaire en dessous des valeurs seuils définies pour des périodes d'exposition spécifiques. La viabilité cellulaire est mesurée via la conversion enzymatique du colorant vital MTT en un sel de formazan bleu mesuré quantitativement après son extraction des tissus. Les substances corrosives sont mises en évidence par leur capacité à faire chuter la viabilité cellulaire sous un seuil prédéterminé.

    Les produits chimiques colorés et ceux qui interfèrent avec le MTT peuvent également être testés par procédure HPLC.

    Plusieurs méthodes validées sont référencées dans la Ligne directrice et suivent la procédure décrite ci-dessus. Certaines méthodes référencées permettent par ailleurs la sous-catégorisation des produits corrosifs.

  • 28-juillet-2015

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    Essai n° 435 : Méthode d'essai in vitro sur membrane d'étanchéité pour la corrosion cutanée

    Cette ligne directrice 435 mise à jour propose une méthode d’essai in vitro sur membrane d’étanchéité qui peut être utilisée pour identifier les produits chimiques corrosifs. La méthode d’essai emploie une membrane artificielle conçue pour au traitement par des produits chimiques de façon similaire à de la peau s’animaux vivants.

  • 28-juillet-2015

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    Test No. 240: Étude étendue de toxicité pour la reproduction sur une génération chez médaka (MEOGRT)

    Cette Ligne directrice décrit un essai de toxicité étendu au-delà d’une génération chez le médaka (Medaka Extended One Generation Test, MEOGRT). C’est un essai complet d’exposition visant à obtenir des données pouvant servir à l’évaluation des dangers et des risques pour l’environnement liés aux produits chimiques, en particulier les produits suspectés d’être des perturbateurs endocriniens (PE). L’exposition dans le test MEOGRT est poursuivie jusqu’à l’éclosion (jusqu’à deux semaines post-fécondation, spf) dans la seconde génération (F2). Plusieurs effets biologiques sont mesurés dans la présente Ligne directrice. Il s’agit en premier lieu de mettre en évidence les effets indésirables potentiels sur des paramètres pertinents en termes de population, tels que la survie, le développement macroscopique, la croissance et la reproduction. En second lieu, afin de disposer d’informations mécanistiques et de pouvoir établir des liens entre les résultats d’autres types d’études de terrain ou de laboratoire établissant a posteriori une activité potentielle de perturbation du système endocrinien (activité androgénique ou œstrogénique dans d’autres tests et essais, par exemple), on obtient d’autres informations utiles en mesurant l’ARNm de la vitellogénine (vtg) (ou la protéine vitellogénine, VTG) et des caractères sexuels secondaires (CSS) phénotypiques liés au sexe génétique, et en procédant à une évaluation histopathologique.

  • 28-juillet-2015

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    Essai n° 483 : Essai d'aberration chromosomique sur spermatogonies de mammifères

    Cet essai mesure les aberrations chromosomiques structurales (de type chromosomique et chromatidique) qui surviennent dans les spermatogonies et devrait par conséquent permettre de prévoir l'induction de mutations héritées dans les cellules germinales. L’essai d’aberration chromosomique pratiqué in vivo sur des spermatogonies de mammifères est destiné à détecter les produits chimiques qui causent des aberrations chromosomiques structurales dans les cellules de spermatogonies de mammifère (1) (2) (3). Par ailleurs, cet essai se prête bien à l’évaluation de la génotoxicité, car, malgré des variations entre les espèces, les facteurs du métabolisme in vivo, la pharmacocinétique et les processus de réparation de l’ADN sont actifs et contribuent aux réponses.

    La Ligne directrice 483 originale a été adoptée en 1997. La présente version modifiée de la ligne directrice reflète les connaissances scientifiques acquises après de nombreuses années d’expérience de cet essai et tient compte des possibilités de l’intégrer ou de le combiner à d’autres études de toxicité ou de génotoxicité.

  • 28-juillet-2015

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    Essai n° 476 : Essais in vitro de mutation génique sur cellules de mammifères utilisant les gènes Hprt et xprt

    L'essai in vitro de mutation génique sur des cellules de mammifères peut être employé pour détecter des mutations induites par les substances chimiques. Dans cet essai, les systèmes genetiques utilisés permettent de détecter une mutation sur les loci de l’hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HPRT) et d’un transgène de la xanthine-guanine phosphoribosyl transferase (XPRT). Les essais de la mutation de HPRT et de XPRT détectent différents types d’événements génétiques.

    Des cellules en suspension ou en culture monocouche sont exposées à quatre concentrations analysables de la substance d'essai au moins, avec et sans activation métabolique, pendant une période appropriée. Elles sont repiquées pour déterminer la cytotoxicité et pour permettre l'expression phénotypique avant la sélection. La cytotoxicité est habituellement déterminée en mesurant l'efficacité de clonage relative (survie) ou la croissance totale relative des cultures après la période de traitement. Les cultures traitées sont maintenues dans le milieu de croissance pendant une période suffisante, caractéristique de chaque locus et de chaque type cellulaire, afin de permettre l'expression phénotypique presque optimale des mutations induites. La fréquence de mutant est déterminée par l’ensemencement d’un nombre connu de cellules dans le milieu contenant l'agent sélectif pour détecter des cellules mutantes, et dans le milieu sans agent sélectif pour déterminer l'efficacité de clonage (viabilité). Après un temps approprié d'incubation, des colonies sont comptées.

  • 28-juillet-2015

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    Essai n° 493 : Ligne directrice axée sur la performance pour les essais in vitro faisant appel au récepteur d'oestrogène recombinant humain (hrER) pour la détection des substances ayant une affinité de liaison avec les récepteurs des oestrogènes

    La présente Ligne directrice pour les essais axée sur la performance (LDAP) décrit la méthodologie des essais in vitro  faisant appel au récepteur d’œstrogène recombinant humain pour la détection des substances ayant une affinité de liaison avec les récepteurs des œstrogènes (essais de liaison au hrER). Elle comprend deux méthodes d’essai structurellement et fonctionnellement similaires pour détecter les ligands des récepteurs des œstrogènes (ERα), et doit faciliter l’élaboration de nouvelles méthodes similaires ou modifiées. La base de la présente LDAP est constituée de deux méthodes d’essai de référence. Ces deux méthodes sont les suivantes: l'essai de Freyberger-Wilson (FW), essai in vitro de liaison aux ER à l’aide d’un ERα humain intégral et l'essai du Chemical Evaluation and Research Institute (CERI), essai in vitro de liaison aux ER à l’aide du domaine de liaison du ligand d’un ER recombinant humain. Cet essai consiste principalement à mesurer la capacité d’un ligand radiomarqué (le [3H]-17β-œstradiol) à se lier aux ER en présence de concentrations croissantes du produit chimique testé (appelé « compétiteur »). Les produits chimiques d’essai qui présentent une forte affinité de liaison avec les ER entrent en concurrence avec le ligand radiomarqué à une concentration plus faible que les composés ayant une affinité moindre vis-à-vis du récepteur. L’essai comporte deux grands éléments : une expérience de liaison à saturation pour établir les paramètres de l’interaction récepteur-ligand et documenter la spécificité des liaisons aux ER, puis une expérience de liaison compétitive visant à déterminer dans quelle mesure un produit chimique testé fait concurrence à un ligand radiomarqué pour se fixer aux ER. Les présentes méthodes sont proposées à des fins de dépistage et de priorisation, mais elles peuvent aussi livrer des informations sur les mécanismes d’action pouvant être utilisées dans le cadre d’une approche fondée sur le poids de la preuve.

  • 28-juillet-2015

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    Essai n° 241 : Essai de croissance et de développement de larves d'amphibiens (LAGDA)

    La ligne directrice pour l’essai de croissance et de développement de larves d’amphibiens (LAGDA) décrit un essai de toxicité mené sur une espèce d’amphibiens (xénope lisse (Xenopus laevis)); cet essai (d’une durée de 16 semaines, en général) consiste à étudier la croissance et le développement des amphibiens depuis la fécondation jusqu’à la période juvénile précoce. Il permet d’évaluer le développement initial, la métamorphose, la survie, la croissance et la maturation partielle du système reproducteur. Il permet également de mesurer une série d’autres effets observés en vue d’une évaluation diagnostique des produits chimiques suspectés d’être des perturbateurs endocriniens, ou d’autres types de substances ayant des effets toxiques sur le développement et la reproduction. Le LAGDA est utilisé comme essai de niveau supérieur sur amphibien pour recueillir des informations plus complètes sur les relations concentration-réponse induisant des effets néfastes, informations qui servent ensuite pour l’identification et la caractérisation des dangers ainsi que pour l’évaluation du risque écologique. Le plan expérimental général comprend l’exposition d’embryons de X. laevis au stade de développement 8-10 d’après Nieuwkoop et Faber (NF) (3) à un minimum de quatre concentrations différentes du produit chimique testé et un/des témoin(s) jusqu’à 10 semaines après le délai médian jusqu’au stade NF62 dans le témoin. Chaque concentration d’essai est testée sur quatre réplicats, avec huit réplicats pour le témoin. Les effets observés évalués au cours de l’exposition (dans le sous-échantillon provisoire et l’échantillon final à l’achèvement de l’essai) sont ceux qui constituent des indicateurs de toxicité générale, à savoir mortalité, comportement anormal et déterminants de la croissance (longueur et poids), ainsi que ceux conçus pour caractériser les mécanismes d’action des perturbateurs endocriniens ciblant les processus physiologiques faisant intervenir les œstrogènes, les androgènes et la thyroïde.

  • 28-juillet-2015

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    Essai n° 404 : Effet irritant/corrosif aigu sur la peau

    Cette méthode fournit des informations sur les dangers pour la santé qui peuvent résulter d’une exposition à une substance d’essai solide ou liquide par voie dermique. Cette Ligne directrice recommande des stratégies séquentielles d'essai, qui incluent l'exécution d’essais in vitro ou ex vivo validés et admis pour la corrosion/irritation.

    Le lapin albinos est l’animal de laboratoire préférable. La substance à tester est appliquée en dose unique sur une petite surface de la peau (approximativement 6 cm²) d’un animal ; les surfaces non traitées de sa peau servent de contrôle. L’exposition est de 4 heures. Des résidus de la substance d’essai doivent ensuite être retirés. La dose appliquée sur le site d’essai est de 0.5 ml (liquide) ou de 0.5g (solide). La méthode consiste en deux essais : l’essai initial et l’essai de confirmation (employé uniquement s’il n’y a pas d’effet corrosif observé avec l’essai initial). Tous les animaux sont examinés pour les érythèmes ou les oedèmes pendant 14 jours. Les scores d'irritation dermique doivent être évalués en conjonction avec la nature et la sévérité des lésions, et leur présence ou absence de réversibilité. Quand des réponses persistent jusqu’à la fin de la période d’observation de 14 jours, la substance d’essai doit être considérée comme irritante.

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  • 28-juillet-2015

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    Essai n° 439 : Irritation cutanée in vitro: essai sur épiderme humain reconstitué

    Cette Ligne directrice décrit une procédure in vitro qui peut être utilisée pour identifier les dangers présentés par les produits chimiques irritants (substances et mélanges) conformément à la Catégorie 2 du Système général harmonisé de classification et d’étiquetage (SGH) de l’ONU. Elle s’appuie sur un épiderme humain reconstitué, qui dans sa conception globale, reproduit les propriétés biochimiques et physiologiques de la partie supérieure de la peau humaine. La viabilité cellulaire est mesurée par la conversion enzymatique du colorant vital MTT en un sel de formazan bleu, qui est mesuré quantitativement après extraction des tissus. Les produits chimiques testés irritants sont identifiés par leur capacité à réduire la viabilité cellulaire au-dessous d’un seuil défini (inférieur ou égal à 50% pour la Catégorie 2 du SGH de l’ONU). Cette Ligne directrice comprend aussi des normes de performance pour l’évaluation de méthodes d’essai similaires ou modifiées sur épiderme humain reconstitué. Quatre méthodes d’essai validées sont conformes à cette Ligne directrice. En fonction du cadre législatif et du système de classification utilisé, cette procédure peut être utilisée pour déterminer l’irritation cutanée de produits chimiques testés, en tant qu’essai de substitution d’essai d’irritation cutanée in vivo, ou en tant qu’essai de substitution partiel, dans le cadre d’une stratégie d’essai à plusieurs niveaux.

    Les produits chimiques colorés et ceux qui interfèrent avec le MTT peuvent également être testés par procédure HPLC.

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