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La présente Ligne directrice (LD) décrit l’utilisation d’hépatocytes de truite arc-en-ciel Oncorhynchus mykiss (RT-HEP) cryoconservés afin de déterminer la clairance intrinsèque in vitro (CL, IN VITRO, INT) du produit chimique testé, par une approche fondée sur la déplétion du substrat. La réaction est déclenchée par l’addition du produit chimique testé à la suspension. Pour collecter des échantillons à différents points dans le temps, on arrête la réaction en transférant des aliquotes de la suspension dans une solution d’arrêt. La diminution de la concentration de produit chimique testé dans les échantillons provenant du flacon d’incubation est mesurée par une méthode analytique validée, et utilisée pour déterminer la CL IN VITRO, INT.La valeur obtenue peut alors être utilisée pour améliorer les prédictions in silico de la bioaccumulation du produit chimique chez le poisson.

La présente Ligne directrice (LD) décrit l’utilisation de la fraction subcellulaire S9 du foie de truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) (RT-S9) afin de déterminer la clairance intrinsèque in vitro (CL IN VITRO, INT) du produit chimique testé, par une approche fondée sur la déplétion du substrat. La réaction est déclenchée par l’addition du produit chimique testé dans le milieu d’incubation contenant le RT-S9. Pour collecter des échantillons à différents points dans le temps, on arrête la réaction en transférant des aliquotes du milieu d’incubation dans une solution d’arrêt. La diminution de la concentration de produit chimique testé dans les échantillons provenant du flacon d’incubation est mesurée par une méthode analytique validée, et utilisée pour déterminer la CL IN VITRO, INT. La valeur obtenue peut alors être utilisée pour améliorer les prédictions in silico de la bioaccumulation du produit chimique chez le poisson.

La présente Ligne directrice décrit une procédure in vitro permettant l’identification de produits chimiques (substances et mélanges) ne relevant d’aucune classification pour l’irritation oculaire ou les lésions oculaires graves, conformément au SGH de l’ONU. Un modèle d’épithélium cornéen humain reconstitué (EChR) est utilisé, qui reproduit fidèlement les propriétés histologiques, morphologiques, biochimiques et physiologiques de l’épithélium cornéen humain. Le test évalue le danger potentiel qu’un produit chimique testé présente pour l’œil en se fondant sur sa capacité à provoquer une cytotoxicité sur un modèle tissulaire d’EChR, mesurée avec le test MTT. Les produits chimiques colorés et ceux qui interfèrent avec le MTT peuvent également être testés par procédure HPLC.La viabilité du tissu d’EChR après exposition à un produit chimique testé est déterminée par comparaison avec celle de tissus traités avec la substance servant de témoin négatif (% de viabilité) puis utilisée pour prédire le danger potentiel du produit chimique testé pour les yeux. Les produits chimiques qui ne relèvent d’aucune classification dans le SGH de l’ONU sont ceux qui ne provoquent pas une diminution de la viabilité tissulaire en deçà d’un seuil défini (à savoir, viabilité tissulaire > 60 % pour le classement « sans catégorie » du SGH de l’ONU).

Cette Ligne directrice décrit un test d’exposition de courte durée in vitro de cytotoxicité, réalisé sur une monocouche confluente de fibroblastes de cornée de lapin du Statens Seruminstitut (SIRC), cultivés sur des plaques microtitres 96 puits. Après 5 minutes d’exposition à un produit chimique testé, on détermine quantitativement la cytotoxicité en mesurant, à l’aide du test MTT, la viabilité relative des cellules SIRC. L’observation d’une diminution de la viabilité cellulaire est utilisée pour prédire les effets indésirables potentiels pouvant provoquer des lésions oculaires. La viabilité cellulaire est évaluée par un dosage quantitatif des cristaux de formazan bleu extraits des cellules et produits par les cellules vivantes lors de la conversion enzymatique du colorant vital MTT, encore appelé Bleu de thiazol. La viabilité cellulaire observée est comparée à celle du témoin avec solvant (viabilité relative) et utilisée comme estimation du danger potentiel pour les yeux que présente le produit chimique testé. Les produits chimiques testés sont classés dans la catégorie 1 du SGH de l’ONU lorsqu’une viabilité cellulaire inférieure ou égale à (≤) 70% est observée aux deux concentrations testées (5 % et 0.05 %). À l’inverse, les produits chimiques pour lesquels la viabilité cellulaire est supérieure à (>) 70 % aux deux concentrations testées (5 % et 0.05 %) sont classés « sans catégorie » selon le système SGH.

Cette Ligne directrice  révisée  a été conçue afin de caractériser pleinement la toxicité par inhalation de l’article d’essai, suite à une exposition répétée sur une période de temps limitée (28 jours), et de fournir des données pour l’évaluation quantitative des risques liés à l’inhalation. Elle a été mise à jour en 2017 afin de permettre de tester et caractériser les effets des nanomatériaux.Des groupes de rongeurs (5 mâles et 5 femelles) sont exposés 6 heures par jour pendant une période de 90 jours a) à la substance d’essai à trois niveaux de concentration ou plus, b) à de l’air filtré (témoin négatif), et/ou c) au véhicule (groupe témoin du véhicule). Les animaux sont exposés en général 5 jours par semaine, mais il est aussi permis de les exposer 7 jours par semaine. Des mâles et des femelles sont toujours utilisés, mais peuvent être exposés à des niveaux de concentration différents si l’un des sexes est connu pour être plus sensible à une substance d’essai donnée. Les résultats de l’étude incluent des mesures et des observations quotidiennes détaillées (hématologie et chimie clinique) ainsi qu’une autopsie générale, le poids des organes et de l’histopathologie. Afin de mieux caractériser la toxicité de la substance d’essai, la Ligne directrice laisse la possibilité d’inclure des groupes satellites (réversibilité), des lavages broncho-alvéolaires, la mesure de la charge pulmonaire pour les particules, des tests neurologiques et des évaluations histopathologiques ou de pathologie clinique supplémentaires.

La présente Ligne directrice (LD) pour les essais de produits chimiques fondée sur les événements clés porte sur le danger de sensibilisation cutanée pour la santé humaine faisant suite à une exposition avec un produit chimique. Elle porte plus particulièrement sur l’activation des cellules dendritiques, qui est un événement clé de la voie toxicologique impliquée dans les effets indésirables (AOP) pour la sensibilisation cutanée. La sensibilisation cutanée se réfère à une réponse allergique faisant suite à un contact avec la peau, selon la définition du Système général harmonisé de classification et d'étiquetage des produits chimiques (SGH) des Nations Unies.La présente LD décrit trois méthodes in vitro portant sur le même événement clé : (i) le test d’activation de la lignée cellulaire humaine (h-CLAT), (ii) le test d’activation de la lignée cellulaire U937 (U-SENS) et (iii) l’essai par gène rapporteur de l’interleukine 8 (essai IL‑8 Luc). Ils sont tous utilisés pour aider à distinguer les sensibilisants des non-sensibilisants cutanés, selon le SGH. Les méthodes décrites dans la présente LD permettent de quantifier soit les variations d’expression de marqueurs de surface associés au processus d’activation des monocytes et des DC suite à l’exposition à un sensibilisant (CD54 et CD86, par exemple), soit les changements d’expression de l’IL‑8, une cytokine associée à l’activation des DC. Dans les essais h-CLAT et U-SENS, la variation d’expression des marqueurs de surface est mesurée par cytométrie en flux après coloration cellulaire avec des anticorps marqués par fluorochrome. Dans l’essai IL-8 Luc, la variation d’expression de IL-8 est mesurée de façon indirecte via l’activité du gène de la luciférase qui se trouve sous contrôle du promoteur IL-8. L’intensité relative de fluorescence ou luminescence des cellules traitées, comparée à celle du témoin de solvant/véhicule, est calculée et utilisée dans un modèle prédictif, pour aider à distinguer les sensibilisants des non-sensibilisants.