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La présente ligne directrice décrit les effets d'un produit chimique d’essai sur le fonctionnement de la reproduction chez le mâle et la femelle. Elle a été mise à jour par l'ajout de paramètres relatifs à la détection des perturbateurs endocriniens, en particulier la mesure de la distance ano-génitale et l’examen de la persistance du mamelon chez les petits, ainsi qu'un examen thyroïdien.

La substance d’essai est administrée en doses graduées à plusieurs groupes de mâles et de femelles. Les mâles doivent être traités pendant un minimum de quatre semaines. Les femelles doivent être traitées tout au long de l’étude, soit approximativement 63 jours. Normalement des accouplements « un mâle pour une femelle » doivent être employés dans cette étude. Cette Ligne directrice utilise le rat. Il est recommandé que chaque groupe commence avec au moins dix animaux de chaque sexe. Généralement, au moins trois groupes d’essai et un groupe contrôle doivent être utilisés. Des niveaux de dose peuvent être basés sur l'information des essais de toxicité aiguë ou sur des résultats d’études à doses répétées. La substance d'essai est administrée oralement et quotidiennement. Les résultats de cette étude incluent des observations cliniques, la mesure du poids corporel et la consommation de nourriture/eau, la surveillance du cycle oestral, la mesure/observation des caractéristiques de la descendance, la mesure du taux sérique d'hormones thyroïdiennes, de même qu’une autopsie générale et l'histopathologie. Les résultats de cette étude de toxicité devraient être évalués en termes d'effets observés, autopsie et résultats microscopiques. En raison de la période courte du traitement du mâle, l'histopathologie du testicule et l'épididyme doivent être pris en compte avec les données de fertilité, lors de l’évaluation des effets reproducteurs mâles.

L’essai de mutation létale dominante a pour but de détecter si certaines substances chimiques engendrent des mutations résultant d’aberrations chromosomiques dans les cellules germinales. En outre, l’essai de mutation létale dominante se prête bien à l’évaluation de la génotoxicité, car, malgré des variations entre les espèces, les facteurs du métabolisme in vivo, la pharmacocinétique et les processus de réparation de l’ADN sont actifs et contribuent aux réponses. L’apparition d’une mutation létale dominante à la suite d’une exposition à un produit chimique d’essai indique que cette substance a affecté le tissu germinal de l’animal étudié.

La LD 478 initiale a été adoptée en 1984. La présente version modifiée de cette ligne directrice reflète plus de trente années d’expérience de cet essai et tient compte des possibilités de l’intégrer ou de le combiner à d’autres essais de toxicité, notamment pour le développement, la reproduction ou encore des essais de génotoxicité; cependant, étant donné les limitations de l’essai et le grand nombre d’animaux utilisés, cet essai n’a pas vocation à être utilisé en première intention, mais plutôt comme méthode d’essai supplémentaire quand il n’existe pas d’alternative pour satisfaire les exigences réglementaire.

L'essai in vitro de mutation génique sur des cellules de mammifères peut être employé pour détecter des mutations induites par les substances chimiques. Dans cet essai, les systèmes genetiques utilisés permettent de détecter une mutation sur les loci de l’hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HPRT) et d’un transgène de la xanthine-guanine phosphoribosyl transferase (XPRT). Les essais de la mutation de HPRT et de XPRT détectent différents types d’événements génétiques.

Des cellules en suspension ou en culture monocouche sont exposées à quatre concentrations analysables de la substance d'essai au moins, avec et sans activation métabolique, pendant une période appropriée. Elles sont repiquées pour déterminer la cytotoxicité et pour permettre l'expression phénotypique avant la sélection. La cytotoxicité est habituellement déterminée en mesurant l'efficacité de clonage relative (survie) ou la croissance totale relative des cultures après la période de traitement. Les cultures traitées sont maintenues dans le milieu de croissance pendant une période suffisante, caractéristique de chaque locus et de chaque type cellulaire, afin de permettre l'expression phénotypique presque optimale des mutations induites. La fréquence de mutant est déterminée par l’ensemencement d’un nombre connu de cellules dans le milieu contenant l'agent sélectif pour détecter des cellules mutantes, et dans le milieu sans agent sélectif pour déterminer l'efficacité de clonage (viabilité). Après un temps approprié d'incubation, des colonies sont comptées.

La présente Ligne directrice pour les essais axée sur la performance (LDAP) décrit la méthodologie des essais in vitro  faisant appel au récepteur d’œstrogène recombinant humain pour la détection des substances ayant une affinité de liaison avec les récepteurs des œstrogènes (essais de liaison au hrER). Elle comprend deux méthodes d’essai structurellement et fonctionnellement similaires pour détecter les ligands des récepteurs des œstrogènes (ERα), et doit faciliter l’élaboration de nouvelles méthodes similaires ou modifiées. La base de la présente LDAP est constituée de deux méthodes d’essai de référence. Ces deux méthodes sont les suivantes: l'essai de Freyberger-Wilson (FW), essai in vitro de liaison aux ER à l’aide d’un ERα humain intégral et l'essai du Chemical Evaluation and Research Institute (CERI), essai in vitro de liaison aux ER à l’aide du domaine de liaison du ligand d’un ER recombinant humain. Cet essai consiste principalement à mesurer la capacité d’un ligand radiomarqué (le [3H]-17β-œstradiol) à se lier aux ER en présence de concentrations croissantes du produit chimique testé (appelé « compétiteur »). Les produits chimiques d’essai qui présentent une forte affinité de liaison avec les ER entrent en concurrence avec le ligand radiomarqué à une concentration plus faible que les composés ayant une affinité moindre vis-à-vis du récepteur. L’essai comporte deux grands éléments : une expérience de liaison à saturation pour établir les paramètres de l’interaction récepteur-ligand et documenter la spécificité des liaisons aux ER, puis une expérience de liaison compétitive visant à déterminer dans quelle mesure un produit chimique testé fait concurrence à un ligand radiomarqué pour se fixer aux ER. Les présentes méthodes sont proposées à des fins de dépistage et de priorisation, mais elles peuvent aussi livrer des informations sur les mécanismes d’action pouvant être utilisées dans le cadre d’une approche fondée sur le poids de la preuve.

La ligne directrice pour l’essai de croissance et de développement de larves d’amphibiens (LAGDA) décrit un essai de toxicité mené sur une espèce d’amphibiens (xénope lisse (Xenopus laevis)); cet essai (d’une durée de 16 semaines, en général) consiste à étudier la croissance et le développement des amphibiens depuis la fécondation jusqu’à la période juvénile précoce. Il permet d’évaluer le développement initial, la métamorphose, la survie, la croissance et la maturation partielle du système reproducteur. Il permet également de mesurer une série d’autres effets observés en vue d’une évaluation diagnostique des produits chimiques suspectés d’être des perturbateurs endocriniens, ou d’autres types de substances ayant des effets toxiques sur le développement et la reproduction. Le LAGDA est utilisé comme essai de niveau supérieur sur amphibien pour recueillir des informations plus complètes sur les relations concentration-réponse induisant des effets néfastes, informations qui servent ensuite pour l’identification et la caractérisation des dangers ainsi que pour l’évaluation du risque écologique. Le plan expérimental général comprend l’exposition d’embryons de X. laevis au stade de développement 8-10 d’après Nieuwkoop et Faber (NF) (3) à un minimum de quatre concentrations différentes du produit chimique testé et un/des témoin(s) jusqu’à 10 semaines après le délai médian jusqu’au stade NF62 dans le témoin. Chaque concentration d’essai est testée sur quatre réplicats, avec huit réplicats pour le témoin. Les effets observés évalués au cours de l’exposition (dans le sous-échantillon provisoire et l’échantillon final à l’achèvement de l’essai) sont ceux qui constituent des indicateurs de toxicité générale, à savoir mortalité, comportement anormal et déterminants de la croissance (longueur et poids), ainsi que ceux conçus pour caractériser les mécanismes d’action des perturbateurs endocriniens ciblant les processus physiologiques faisant intervenir les œstrogènes, les androgènes et la thyroïde.

Cette méthode fournit des informations sur les dangers pour la santé qui peuvent résulter d’une exposition à une substance d’essai solide ou liquide par voie dermique. Cette Ligne directrice recommande des stratégies séquentielles d'essai, qui incluent l'exécution d’essais in vitro ou ex vivo validés et admis pour la corrosion/irritation.

Le lapin albinos est l’animal de laboratoire préférable. La substance à tester est appliquée en dose unique sur une petite surface de la peau (approximativement 6 cm²) d’un animal ; les surfaces non traitées de sa peau servent de contrôle. L’exposition est de 4 heures. Des résidus de la substance d’essai doivent ensuite être retirés. La dose appliquée sur le site d’essai est de 0.5 ml (liquide) ou de 0.5g (solide). La méthode consiste en deux essais : l’essai initial et l’essai de confirmation (employé uniquement s’il n’y a pas d’effet corrosif observé avec l’essai initial). Tous les animaux sont examinés pour les érythèmes ou les oedèmes pendant 14 jours. Les scores d'irritation dermique doivent être évalués en conjonction avec la nature et la sévérité des lésions, et leur présence ou absence de réversibilité. Quand des réponses persistent jusqu’à la fin de la période d’observation de 14 jours, la substance d’essai doit être considérée comme irritante.